研究背景与核心难点

肝脏是人体最大的消化腺，承担蛋白质合成、代谢解毒等关键生理功能。由于药物或疾病造成的肝损伤可能超出其再生能力，构建能够准确复刻健康肝脏生理功能的体外三维模型，对提升实验准确性与可靠性、服务药物研发与临床应用具有重要意义。肝脏血管系统高度复杂，在高度血管化组织中，体外构筑可灌注的复杂分支血管网络，是维持充足营养供给、复刻肝脏异质结构与细胞微环境的前提。

三维生物打印可于空间上精确定位多种材料与细胞，推动了复杂血管化、异质化肝组织的体外制造。同轴挤出打印因其简洁高效被广泛用于血管网络构建，但其喷头结构限制了对稳定分叉微血管的成形；温敏溶解牺牲材料、溶解短时效生物墨水形成通道并接种内皮细胞等方法虽能实现分支灌注，却普遍面临频繁换针与多次打印暂停、难以高效规模化的问题。细胞外基质（ECM）对调控肝细胞功能尤为关键，但模量过高的水凝胶会削弱肝细胞功能；传统牺牲打印多采用逐层堆叠，而低模量水凝胶黏度低、难以自支撑，使复杂三维血管化结构的精确成形极为困难，载细胞生物墨水的流变特性亦会在打印中显著改变，损害可打印性。

嵌入式打印因可克服重力、实现全向打印与精确的墨水沉积位置控制而受到广泛关注，其中牺牲嵌入式直写（sacrificial writing into functional tissue, SWIFT）与可逆墨水模板内顺序打印（sequential printing in a reversible ink template, SPIRIT）是构建体外血管化组织的主要路线。SWIFT 以细胞球与胶原为支承基质，SPIRIT 以载细胞 GelMA 微球悬浮于液态 GelMA 基质，二者均对材料选择施加了限制（须用胶原或光固化材料），且载细胞微球的制备复杂、通量低，难以胜任大规模组织构建。本研究提出以明胶微凝胶与低黏度生物材料构成的双相载细胞包埋介质，兼顾材料通用性与微环境可调性，实现大尺寸血管化肝组织的高效构建。

图1（对应原文 Fig.1）：MCCB 双相支撑浴由离散相（明胶微凝胶）与连续相（载细胞液态生物材料）组成，牺牲墨水打印其中后经紫外交联与 37℃ 加热移除，形成可灌注血管网络与多孔结构，并通过原位内皮化构建血管化肝组织。

双相载细胞包埋介质（MCCB）支撑浴设计

该工作的材料核心是可交联双相载细胞包埋介质（microgel-regulated cross-linkable cell-laden biphasic, MCCB）支撑浴，由两部分组成：离散相为机械破碎法制备的明胶微凝胶，连续相为与细胞混合的液态低黏度生物材料（图1）。明胶微凝胶经机械破碎制备，方法高效、低成本、可规模化，且生物相容性良好、升温即可脱除，因此被选作离散相以调控流变与孔隙。

牺牲墨水由 15%（w/v）明胶（type A）溶于磷酸盐缓冲液、37℃ 水浴溶解后均匀分散人脐静脉内皮细胞（HUVEC，密度 5×10⁶ mL⁻¹）制得。连续相生物材料则包括 5%（w/v）甲基丙烯酰化明胶（GelMA-60）含 0.25%（w/v）光引发剂 LAP、2%（w/v）甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA-150K）、5%（w/v）纤维蛋白原及 Matrigel，其中 GelMA 相负载 HepG2 细胞（密度 1×10⁷ mL⁻¹）。上述组分于室温（26℃）下与明胶微凝胶充分混合，即得到载细胞的包埋溶液。通过控制温度使连续相呈液态（G″ > G′）、微凝胶保持固态（G′ > G″），即可形成具备屈服应力与自愈合特性的支撑浴结构，从而兼容材料种类并借微凝胶熔融调节孔隙率与孔径。

图2（对应原文 Fig.2）：MCCB 支撑浴的相变温度、屈服应力（0.9–7.2 Pa）、自愈合能力、温度-黏度曲线，以及不同微凝胶比例/粒径对孔隙结构与 HepG2 增殖/存活的影响。

流变特性与赫歇尔–巴尔克本构

由于明胶为温敏材料，微凝胶与液态水凝胶的混合温度对支撑效果至关重要。团队测定了 10%（w/v）明胶微凝胶与 5% GelMA、5% GelMA+0.5% 纤维蛋白原、2% HAMA、0.8% Matrigel 等低黏度材料的储能模量（G′）与损耗模量（G″）随温度的变化，确定各自相变温度；当这些材料在低于明胶微凝胶相变温度时转为液态并表现出流动-愈合特性，而微凝胶保持固态提供结构支撑，使整体混合基质表现为类宾汉（Bingham）流体。将实验数据代入赫歇尔–巴尔克（Herschel–Bulkley）模型拟合，得到屈服应力介于 0.9 Pa 至 7.2 Pa 之间，说明该体系适用于多种低黏度材料——只要生物材料处于连续相（G″ > G′）、微凝胶处于离散相（G′ > G″）即可形成支撑浴。

高细胞密度会改变相变温度与黏度，从而削弱传统挤出打印的可行性。团队将明胶微凝胶与含高细胞密度（3×10⁷ cells·mL⁻¹）的 5% GelMA 混合，通过调控微凝胶流变维持约 2.2 Pa 的屈服应力；当细胞密度进一步升至 1×10⁸ cells·mL⁻¹ 时，黏度显著下降、GelMA 温敏性几乎消失，屈服应力降至 1.17 Pa，但提高微凝胶占比可抬升屈服应力，从而在高细胞密度组织中实现三维自由血管构建。此外，微凝胶粒径越小，屈服应力与黏度越低、自愈合越强；但粒径过小会削弱打印精度与结构成形，故须维持最小屈服应力以保证稳定打印。综合实验，后续研究将微凝胶平均粒径控制在约 150 µm、微凝胶-水凝胶体积比定为 1:2，实现流变可调、孔隙可调控的嵌入式介质。

直写工艺窗口与可成型条件

打印流程借助计算机辅助设计软件建模，并经 Cura 软件规划打印轨迹、转换为 G-code 指令——这一路径与铂邦 DIW 设备以开源切片软件生成 G-code 的工艺链高度契合。所有打印实验采用 25 G 针头，墨水在 24–26℃ 保温，打印压力稳定在约 150 kPa，打印速度在 0.5–20 mm·s⁻¹ 区间调节以研究丝径范围；载细胞包埋介质填充于对细胞无毒无害的六边形模具中，平台温度维持在 22–26℃ 以防微凝胶熔融。打印完成后移除模具，以可见光（405 nm，20 mW·cm⁻²）照射 10–15 s 交联结构，再于 37℃ 培养箱放置 30 min 移除明胶，形成中空管状结构与多孔结构。

对 DIW/嵌入式打印设备而言，这套工艺提出了明确的参数集与约束：支撑浴须在打印全程维持屈服应力与自愈合，使低黏度牺牲墨水沉积后不溃散、洗除前不坍塌；平台温控与墨水保温共同决定相变窗口；Cura 生成的 G-code 轨迹经 25 G 针头、150 kPa 压力与速度调节协同控制，可重复产出 250–1200 µm 的丝径。紫外交联时序与 37℃ 脱除步骤作为独立于挤出的后处理环节，亦须纳入整机工艺链考量。其材料-设备映射关系，是该类载细胞生物墨水走向稳定复现的关键。

图3（对应原文 Fig.3）：牺牲墨水嵌入式打印（a），不同挤出速率下丝宽与截面形貌（b–c，丝径 250–1200 µm 可调），丝间距精确沉积（d–f），灌注演示（g）及 3D 螺旋/锥体/血管网络结构（h–j）。

丝径调控与中空腔体构建

为验证嵌入式打印对丝径的精确控制，团队将支撑浴注入透明容器，嵌入明胶牺牲墨水图案化细丝，并在墨水中加入绿色荧光颗粒以便观察。依据体积守恒，丝径平方与挤出速度成反比，调节打印速度即可将丝宽在 250 µm 至 1200 µm 间调控；荧光图像显示，无论直径大小，细丝截面均保持圆形轮廓并在支撑浴中稳定存在。相较逐层打印，该方法更快速、高效地构建多层次、跨维度血管结构，并能精确控制丝间距——以约 600 µm 宽细丝、1 mm 中心距打印时，丝边缘间距约 400 µm，接近血液氧扩散极限，这是低黏度材料在空气中难以实现的。

团队进一步以 2 mL MCCB 支撑浴注入定制模具，用混入红色染料的明胶生物墨水构建分叉管，打印后紫外交联、37℃ 孵育脱除牺牲墨水形成中空管，并灌注蓝色墨水评估宏观连通性；此外还构建了血管网络、血管树、3D 连续螺旋、锥体结构与 3D 血管网络等拓扑，脱除牺牲墨水后均以蓝色墨水成功灌注，验证了该技术在复杂三维血管结构成形上的能力。

原位内皮化与血管化肝组织构建

在确立微凝胶支撑浴牺牲打印稳定中空通道的方法后，团队探究了内皮细胞（HUVEC）在结构内成血管的能力。该方法可实现任意复杂度血管的内皮化：将负载 HUVEC 的明胶基牺牲生物墨水嵌入式打印入支撑通道（不含肝细胞），打印交联后于 37℃ 加热释放 HUVEC，实现原位内皮化；为保证腔面均匀贴壁，每 60 min 旋转打印结构一次。团队在六边形模具内构建了仿肝小叶的血管结构用于组织培养，放大可见内皮细胞贴附腔面形成中空管状结构；培养 1、4、7 d 后沿横纵剖面评估微血管功能。

第 1 天内皮细胞均匀贴附于中空腔面、主要呈圆形；第 4 天沿通道拓扑增殖、形态改善、CD31 分泌显著上升、腔面边界更清晰；第 7 天内皮细胞近全覆盖腔面、形成连续紧密连接，CD31 分泌进一步增加，剖面可见出芽现象。量化显示 CD31 分泌在第 4 天较第 1 天上调 12.24 倍、第 7 天上调 27.76 倍。为验证该方法构建体外血管化肝组织模型的适用性，团队将含绿色荧光 HepG2 的 5% GelMA 与微凝胶混合制得支撑浴，用负载红色荧光 HUVEC 的明胶墨水嵌入式打印仿肝小叶血管结构；第 1 天截面即见血管清晰嵌入肝组织、内皮细胞均匀贴附肝细胞，白虚线显示血管分叉处肝细胞留有两处暗区而内皮细胞呈现明确分叉构型，3D 扫描亦显示深度剖面中的沟壑状特征。

图4（对应原文 Fig.4）：仿肝小叶血管结构（a，含内皮细胞），腔内皮 z-stack 共聚焦图像（b），内皮细胞增殖率与 CD31 面积统计（c），及第 1/4/7 天 CD31（红）与 F-actin（绿）荧光染色（d–i）。

图5（对应原文 Fig.5）：第 1 天仿肝小叶血管化肝组织（a），HepG2 与 HUVEC 白框截面及合并图像（b–d），3D 深度扫描（e），以及分叉血管结构中共定位结果（f–h）。

肝功能表征：蛋白合成与代谢

天然肝组织中肝细胞约占 80%、内皮细胞约 5%；HepG2 保留了大部分肝细胞功能特别是代谢活性，是体外肝研究的理想模型。团队将 HepG2（10⁷ mL⁻¹）与 HUVEC（10⁶ mL⁻¹）混合构建六边形边长 7 mm、厚 3 mm 的三维组织模型（混合组），并以所述打印方法构建同尺寸仿肝小叶血管模型（血管组），开展免疫荧光染色、蛋白定量与 mRNA 分析。

蛋白质合成是肝脏核心功能之一，白蛋白维持血浆渗透压并结合多种营养物质，MRP2 则是药物转运、毒素与代谢物排出及胆汁生成的关键。共聚焦显示混合组白蛋白与 MRP2 荧光在第 1 至第 4 天上升、第 7 天渐降；血管组在第 7 天白蛋白与 MRP2 分泌显著更高，可能源于肝细胞与内皮细胞的紧密贴附增强了与周围环境的互作。ELISA 定量白蛋白分泌显示两组第 4 天均下降，但血管组第 7 天显著增强；RT-qPCR 同样证实血管组第 7 天白蛋白与 MRP2 基因表达显著高于混合组。代谢功能方面，CYP3A4 基因在第 7 天两组均上调、血管组更显著；尿素分泌 ELISA 显示混合组第 7 天下降、血管组持续上升。肝损伤相关基因（CK18、ASGPR1、AAT）分析表明，血管组第 7 天 AAT 与 ASGR1 表达显著更高、CK18（凋亡相关）表达更低，提示血管化组织结构支持更好的细胞存活、相对更少的肝损伤。

图6（对应原文 Fig.6）：非血管化与血管化肝组织的白蛋白/MRP2 染色（a–b）、白蛋白与尿素分泌定量（c–d）、以及白蛋白/MRP2/CK18/ASGPR1/AAT/CYP3A4 基因检测（e–j）。

不同血管密度对肝功能的转录组学影响

在确认血管结构对肝功能的增益后，团队进一步探究血管密度的影响：通过控制挤出流量与针头速度维持一致丝径、设计不同血管拓扑，调控肝组织内血管密度，并经转录组测序分析。计算显示高、低血管密度组的血管体积分数分别为 38.1% 与 19.3%。测序结果揭示两组在代谢功能、血管生成及细胞-细胞/细胞-ECM 互作相关基因上存在显著差异：CYP 基因家族（CYP3A5、CYP27A1、CYP39A1、CYP11A1、CYP2E1、CYP1A1、CYP24A1）及肝脂质/氨基酸代谢基因（ACOX2、DGAT2、CXCL8、ANGPTL6、ANGPTL8）在高密度组显著上调；血管生成关键基因 VEGFA、VEGFB、PECAM1、TGFBR2 显著上调，胶原家族（COL9A2、COL7A1、COL4A1、COL6A2）上调、抑制血管生成基因（COL18A1、SERPINF1）下调，提示细胞黏附、迁移与组织修复被增强；RAS 信号调控基因（RASA3、RASA4、RASSF5、RASSF7）亦上调。

团队共鉴定 678 个显著差异表达基因并开展 GO 与 KEGG 富集分析。GO 富集显示高密度组在"未折叠蛋白细胞响应""内质网未折叠蛋白响应"等通路显著上调，与蛋白质合成及 ER 应激响应相关，细胞色素 c 氧化酶组装与化合物解毒通路亦显著上调，与 CYP 家族上调密切关联，提示高密度组药物代谢与解毒功能增强。KEGG 分析显示高密度组在脂质代谢、蛋白质消化与吸收（甘油磷脂代谢等）、花生四烯酸与亚油酸代谢通路及 VEGF 信号通路（血管生成关键通路）显著上调；细胞因子-细胞因子受体互作、ECM-受体互作通路上调，说明增强的细胞黏附与迁移可能促进肝组织修复与血管生成。综上，血管密度提升增强了组织与外界的物质交换、改善细胞微环境，进而提升代谢功能。

图7（对应原文 Fig.7）：不同血管密度肝组织示意（a，高/低密度血管体积分数 38.1%/19.3%），代谢/血管生成/细胞互作相关基因热图（b–d），及 GO 与 KEGG 富集分析（e–f）。

机理层面的工艺启示

该研究的核心贡献在于，以明胶微凝胶与液态生物材料构成的 MCCB 双相载细胞支撑浴，结合嵌入式牺牲直写与紫外交联、原位内皮化，在体外构建了含可灌注血管网络的复杂三维肝组织模型，并系统证实血管化结构与更高血管密度对肝细胞蛋白合成、代谢功能及损伤抗性的增益。相较逐层堆叠方法，该方法显著缩短血管构建时间、降低对载肝细胞生物墨水的剪切力，从而保护大体量体外肝组织的生物活性。

对 DIW/嵌入式打印设备开发而言，其启示是明确的：嵌入式打印把"低黏度软材料难以自支撑"的难题转化为"支撑浴流变窗口"的工程命题——支撑浴的屈服应力（0.9–7.2 Pa）、自愈合速率与温敏相变共同决定可打印性，而微凝胶粒径（约 150 µm）与占比（1:2）则提供孔隙与微环境的可编程调节；以 Cura 规划 G-code 轨迹、25 G 针头、约 150 kPa 压力与 0.5–20 mm·s⁻¹ 速度协同，可将丝径在 250–1200 µm 间线性映射；紫外交联与 37℃ 脱除作为独立于挤出的两步后处理，应纳入整机工艺链通盘设计。材料体系、流变窗口与设备参数的映射关系，是载细胞生物墨水走向稳定复现与大尺寸组织构建的关键。